J. Med. Chem. 2020 · DOI 10.1021/acs.jmedchem.0c00180

论文如何测定五肽的结合能力

先看七条五肽共同采用的测量方法，再看单独针对 WPHPY 开展的三项补充实验。

本项目采用的实验参照七条五肽共同测量 · Fig. 2b

直接 FRET

七条点击环五肽Rhod标签D570–A583短表位Fluo标签

用于计算验证的七条序列

WPHPYEWWFRRNWIRIHWRWTHNWPIDYSPVEYSP

在比较七条五肽的计算结果时，统一采用这组直接 FRET 测出的 Kd 作为实验基准。

七条肽的Kd范围1.3–22 μMWPHPY：1.3 μM
本组Kd最低，被选作后续验证对象。

针对 WPHPY 的三种补充实验

以下三项测试只针对 WPHPY，并不是其余六条五肽的共同测量方法。

仅WPHPYFig. 2e

竞争 FRET

未标记WPHPY短表位Fluo标签

论文报告的Kd1 nM

用未标记的多肽置换荧光示踪肽，以此测定结合情况。

仅WPHPYFig. 2f

直接 FP（荧光偏振）

WPHPYRhod标签全长proMMP2

论文报告的Kd280 nM

直接测定带荧光标签的多肽与全长 proMMP2 蛋白的结合。

仅WPHPYFig. 2g

竞争 FP（荧光偏振）

未标记WPHPY全长proMMP2

论文报告的Kd2.3 nM

用未标记的多肽置换荧光示踪肽，测定其与全长蛋白的结合。

图例色块只用来区分实验类别，不代表亲和力高低；示意图标只代表环肽、短表位和全长蛋白，不是实际的分子空间结构。

三个nM数值来自不同条件下的WPHPY实验，不能当作同一实验的重复值，也不能代替上方七条共同测得的直接FRET数据。

查看实验具体条件与点击环化学结构

这里列出示踪剂浓度、完整点击环结构和实验构成，供需要时核对。其中 nM 是摩尔浓度单位，不是长度单位 nm。

WPHPY 核心之外，计算模型还保留了哪些结构

Pra—W–P–H–P–Y—Az4

Pra的炔基与Az4的叠氮基通过点击反应形成三唑桥，将肽闭合成环

筛选序列橙色部分是参与序列筛选的五个残基。WPHPY指这一段，不是整个分子的全部结构。

闭环骨架蓝色的Pra、Az4及其三唑桥负责闭环，属于实验环肽本身，计算时不能随意删去。

外部标签Rhod和Fluo用来产生荧光检测信号，不属于五肽核心；本项目MD没有加入这些标签。

实验体系与计算模拟体系中分别包含了什么

7 条直接 FRET

Rhod ＋完整点击环肽　↔　Fluo ＋ D570–A583 短表位

1 nM｜竞争 FRET

未标记完整点击环 WPHPY　↔　D570–A583 短表位（Rhod-WPHPY 作示踪剂）

280 nM｜直接 FP

Rhod ＋完整点击环 WPHPY　↔　全长 proMMP2

2.3 nM 竞争 FP

未标记完整点击环 WPHPY　↔　全长 proMMP2（Rhod-WPHPY 作示踪剂）

全长模型：7条五肽各做100 ns MD

未标记完整 Pra/Az4–三唑点击环肽　↔　全长 proMMP2

论文结果	数值	结合双方（实验构成）	检测方法与示踪剂
7 条命中的直接 FRET	1.3–22 μM	带 Rhod 标签的点击环肽＋ Fluo-D570–A583 短表位	直接 FRET｜7 条序列的排名基准固定 100 nM Fluo-短表位，逐渐增加 Rhod-点击环肽。
WPHPY 竞争 FRET	1 nM	未标记 WPHPY ＋短表位	竞争 FRET 固定 100 nM Fluo-短表位和 100 nM Rhod-WPHPY 示踪剂，逐渐增加未标记 WPHPY。
WPHPY 直接 FP	280 nM	带 Rhod 标签 WPHPY ＋全长 proMMP2	直接 FP 固定 100 nM Rhod-WPHPY，逐渐增加全长重组 proMMP2；数值包含 Rhod 标签的影响。
WPHPY 竞争 FP	2.3 nM	未标记 WPHPY ＋全长 proMMP2	竞争 FP 固定 100 nM 全长 proMMP2 和 100 nM Rhod-WPHPY 示踪剂，逐渐增加未标记 WPHPY；与当前全长 MD 构成最接近。

用哪七条五肽检验计算方法

论文 Figure 2b：15条点击环肽序列及其中7条的Kd数据 — 论文 Figure 2b 原图裁切：左侧列出筛选命中的序列，Kd 均来自带标签环肽与短表位的直接 FRET 测定。

15初筛命中的序列

7有定量Kd的序列

1.3–22Kd 范围（μM）

论文初筛得到 15 条命中序列，其中 7 条测出了与 D570–A583 短表位结合的定量 Kd。本项目用这 7 条多肽来检验计算方法：在实验已经知道谁相对更强的前提下，看计算能否给出相近的判断。

强组 · 4 条

WPHPY · EWWFR · RNWIR · IHWRW

Kd：1.3、3.7、6.3、7.4 μM

弱组 · 3 条

THNWP · IDYSP · VEYSP

Kd：21、21、22 μM

这里按Kd在7.4与21 μM之间的间隔，将七条肽暂分为四条较强、三条较弱。这只是本项目方便比较的分组，不是通用的活性标准。

计算是怎样检验这些已知五肽的

确定实验参照

统一使用七条多肽都有的直接 FRET Kd。

建立完整环肽模型

建模不仅包含五肽核心序列，也完整保留 Pra 与 Az4 形成的三唑闭环结构。

选定受体目标片段

选用 D570–A583 短表位，对应直接 FRET 实验中的测试靶标。

寻找结合姿态

用 Glide 生成结合姿态，记录对接评分和合格姿态的产出比例。

检查空间接触位置

看多肽是否接触目标表位，以及是否覆盖 TIMP2 参考区域。

换用另一种评分交叉核对

用 Rosetta 对同一批姿态计算配体界面评分。

用于后续六肽筛选

先明确评价指标和计算设置，再去比较新设计的六肽。

静态对接指标：每个数值是什么意思

先看每项指标代表什么，再看下一张表里的实际数值。实验 Kd 来自实验测量，其余五项来自静态计算评估。

实验Kd

实验里，哪条肽结合更强？

这是实验测得的平衡解离常数，用来对照计算结果。

Kd 越低，实验测得的结合越强。

这是实验数据，不是对接软件给出的评分。

GlideScore｜对接评分

软件怎样评价这个结合姿态？

用 Glide 经验评分函数给生成的结合姿态打分。

数值越负，通常代表软件评估该构象越有利。

该经验分值不能直接换算成实验 Kd。

结合姿势产出率

流程容易生成合格的结合姿态吗？

统计对接流程中成功输出的合格姿态比例。

比例越高，表示该流程针对该多肽越容易生成合格姿态。

姿态产出率反映的是对接输出情况，不是实验结合概率。

表位接触残基数

多肽接触了多少个表位残基？

在短表位的 14 个残基中，统计有多少个与环肽发生接触。

接触残基越多，通常表示表位被接触的范围越广。

接触残基多，并不等于实验结合力更强。

TIMP2参考区域覆盖比例

多肽覆盖了多少 TIMP2 参考区域？

看 TIMP2 接触的那片表位中，有多少残基也被环肽接触。

比例越高，覆盖的参考区域就越多。

该数值只反映几何位置重叠，不是实验测得的抑制率。

Rosetta界面评分｜LigInterfaceEnergy

另一种软件给出的界面评分如何？

用另一个软件对完全相同的结合姿态重新评估界面作用。

评分越负，通常代表软件评估该界面相互作用越有利。

这是另一种计算评分，不是独立的实验验证。

除了实测 Kd，其余都是计算指标，只能辅助初筛，不能直接证明哪条肽的实验亲和力最高。

查看计算细节、公式与本批统计结果

实验参照

实验参照：平衡解离常数（Kd）

Kd 是实验测得的热力学平衡解离常数。本页用 Figure 2b 的直接 FRET Kd 作为基准，检验计算能否分出七条多肽的相对强弱。

Kd 越低，代表实验结合越强。

它是实验测出的物理量，不是计算评分；也不能把另一种实验测得的 2.3 nM 直接并入这七条多肽的排名中。

软件对接评分

对接评分：GlideScore

Glide 依据结合构象中的相互作用给出经验评分；本页只横向比较使用同一套流程得到的姿态。

数值越负通常越有利。本批数据中，AUC = 1.000，与 Kd 的 Spearman ρ = 0.667。

该指标可用于初始筛选，但它不是真实的结合自由能，也不能直接换算成 Kd。

成功输出的比例

对接成功率：结合姿态产出率

对每种输入的分子形式（微状态），流程尝试输出 10 个姿态。用成功输出的比例，比较输入微状态数量不同的多肽。

成功姿势数 ÷（10 × 有效微状态数）

计算公式为：成功姿态数 ÷（10 × 有效微状态数）。比例越高，表示流程越容易生成合格姿态。本批数据中 AUC = 1.000，ρ = −0.895。

它描述的是对接阶段的输出能力，不是分子动力学模拟中维持结合的时间比例。

接触到了多少残基

接触范围：短表位接触残基数

在选出的结合姿态里，统计 14 个短表位残基中有多少个与环肽发生接触（按重原子距离不超过 4.5 Å 判定）。

通常接触残基越多，表位覆盖越广。本批数据中，区分强弱的 AUC = 0.958，与 Kd 的 ρ = −0.578。

它说明构象覆盖了多大范围；接触残基多，并不自动意味着实验结合亲和力更高。

是否覆盖参考区域

功能表位重叠：TIMP2 参考区域覆盖比例

参考 TIMP2–proMMP2 晶体复合物，先找出短表位中与 TIMP2 接触的 10 个残基，再统计其中被环肽覆盖了多少个。

环肽覆盖的 TIMP2 表位残基数 ÷ 10

计算公式为：环肽覆盖的 TIMP2 表位残基数 ÷ 10。比例越高，表示与参考位点重叠越多。本批数据中 AUC = 0.917，ρ = −0.467。

它只描述局部的空间重叠，不是实验测得的 TIMP2 抑制率，也不是整个蛋白界面的覆盖率。

Rosetta 界面能

界面能评分：LigInterfaceEnergy

针对同一批结合姿态，用 Rosetta 的 ref2015 打分函数重新计算环肽与受体的界面作用，核对另一种评分是否也支持实验强弱分组。

分值越负通常越有利。本批数据中，AUC = 1.000，与 Kd 的 ρ = 0.775。

其单位为 Rosetta 能量单位（REU），不是 kcal/mol。计算时将完整点击环按一个整体配体评分，不能与 FlexPepDock 或 InterfaceAnalyzer 的计算结果直接混用。

七条五肽的实验 Kd 与静态评分对照

强组（Kd 1.3–7.4 μM）弱组（Kd 21–22 μM）

序列	实验 Kd μM	GlideScore	姿势产出率	D570–A583 接触数	TIMP2 靶表位覆盖	LigInterfaceEnergy REU
WPHPY	1.3	−4.5643	100%	5	40%	−14.928
EWWFR	3.7	−5.0729	100%	7	50%	−13.496
RNWIR	6.3	−6.5138	100%	6	50%	−16.455
IHWRW	7.4	−6.0030	100%	7	50%	−9.796
THNWP	21.0	−3.7854	45%	5	40%	−8.728
IDYSP	21.0	−3.6525	80%	3	30%	−8.638
VEYSP	22.0	−3.6405	30%	4	40%	−9.094

静态评分能不能分出实验强弱

AUC 1.000GlideScore

AUC 1.000姿势产出率

AUC 0.958表位接触数

AUC 0.917TIMP2 表位覆盖

AUC 1.000LigInterfaceEnergy

AUC 用于看指标能否区分强弱：0.5 接近随机猜测，1.0 表示该指标在本批七条已知多肽中把强、弱两组完全分开；这不代表面对新序列时也一定能分对。

Spearman ρ 衡量排序一致性：本节直接比较指标与 Kd。当两者都是数值越低越好时，预期为正相关；当指标越高越好、Kd 越低越好时，预期为负相关。

本批测试结果显示：GlideScore、姿态产出率和 Rosetta 界面评分都完全分开了实验强弱两组；两项空间接触指标也表现出一定的区分能力。

但不能据此过度推论：这些静态指标无法准确预测具体的 Kd 数值，也不能保证强结合组内部四条多肽的排序顺序。多项指标均基于同一批对接姿态得出，不能当作多次独立的重复验证。

文献：Sarkar et al., Inhibiting Matrix Metalloproteinase-2 Activation by Perturbing Protein-Protein Interactions Using a Cyclic Peptide, J. Med. Chem. (2020), DOI 10.1021/acs.jmedchem.0c00180。计算数据：model2_integrated_features.csv；接触阈值 4.5 Å；Rosetta 使用 ref2015，LigInterfaceEnergy 的界面距离阈值为 8.0 Å。

动力学模拟体系与实验体系有哪些不同

MD保留了完整点击环
包括五肽核心、Pra、Az4和三唑闭环，不加荧光标签。受体分别使用孤立短表位和全长proMMP2。

直接FRET测的是带标签的短表位体系
MD都没有Rhod/Fluo。短表位MD与实验靶标更接近，但仍少了标签；全长MD还换了受体环境，两种模型都不是实验的完全复现。

标签已经没有加入MD

模拟中没有加入荧光标签，实验中则用标签产生检测信号。两者设置不同；没有标签的模型也不能用来排除实验中的标签效应。

不能直接删掉闭环部分

如果在模型中删去 Pra、Az4 及三唑环，所模拟的分子就不再是实验中的点击环肽；线性肽或其它闭环分子只能作为独立的分子对照，不能直接替代。

如果要研究环化的作用

若想明确环化结构的作用，可以另行安排完整点击环肽与线性 WPHPY 在相同条件下的独立重复 MD；这是有待开展的对照建议，不是用来替代下方七条多肽排名的现有数据。

删去闭环不是简单地“简化模型”：它会改变肽能采取的形状和接触方式。论文中的线性WPHPY也没有同样的MMP2抑制效果，因此不能用去环化结构代替真实点击环肽。

只模拟短表位时，五肽表现如何

本节用 −log10(Kd) 表示实验结合强弱，数值越高表示实验结合越强。因此，正的 ρ 表示实验较强的肽往往具有更高的模拟接触指标。这里使用的实验量与静态部分不同，解读正负号时不能混淆。

短表位模型保留了部分实验强弱趋势，但 IHWRW 的接触明显偏高

在模拟中，WPHPY 保持了较多接触，VEYSP 接触较少，与实验亲和力趋势一致；但 IHWRW 在模拟中的接触指标最高。如果仅为了检查这个单一样本的影响而暂不计入 IHWRW，两项主要指标的 Spearman ρ 均为 0.812。正式评价仍必须看全部七条，不能靠人为删去异常样本来证明方法有效。

全部 7 条 · 两个主要指标ρ 0.595

全部 7 条样本的两个主要指标 AUC 均为 0.833；每条模拟时长 100 ns，包含 5002 帧。由于总共只有七条样本，相关性尚未达到统计显著，不能据此认定该模型能可靠预测亲和力。

序列	实验 Kd μM	结合样状态占比	表位接触占有率	平均表位覆盖率	几何阻断占有率	与实验趋势
WPHPY	1.3	64.1%	73.2%	42.1%	68.6%	符合强结合趋势
EWWFR	3.7	30.9%	35.4%	26.9%	54.0%	基本符合
RNWIR	6.3	24.6%	27.5%	20.1%	27.3%	强组边界
IHWRW	7.4	98.5%	100.0%	64.6%	98.5%	特殊：模拟过稳定
THNWP	21.0	29.1%	30.1%	23.5%	34.8%	弱组边界
IDYSP	21.0	33.9%	36.4%	22.4%	39.0%	弱组边界
VEYSP	22.0	5.4%	8.6%	12.8%	10.6%	符合弱结合趋势

Bound-like population满足本分析接触与几何条件的帧比例，简称“结合样状态”，不是实验测到的结合概率。

表位接触占有率达到预设表位接触条件的帧比例；具体条件见下方六肽部分的指标说明。

平均表位覆盖率每一帧接触到的表位残基数除以14，再对整条轨迹取平均。

TIMP2 阻断占有率达到TIMP2参考区域接触条件的帧比例，只说明几何覆盖，不是实验抑制率。

IHWRW为什么需要单独看：实验中它属于较强组，排序是第四；模拟却给了它最高的覆盖和阻断指标。问题不是“实验无效”，而是模型把它相对评得过高。

仍有分不清的情况：RNWIR与弱组THNWP、IDYSP在部分指标上交叉。因此这里只能说保留了部分局部接触趋势，不能把MD数值换算成Kd。

体系：完整未标记 Pra/Az4–三唑点击环肽 + 加帽 D570–A583 孤立表位；每条 100.000 ns、5002 帧。模拟从已有复合物姿势开始，检查它随后怎样变化；不是让肽从溶液中自行找到结合位点，也不是盲对接。

换成全长蛋白后，结果有没有更接近实验

全长模型的相对强弱排序仍与实验不一致

在模拟中，WPHPY、EWWFR 和 RNWIR 大多离开了目标表位；IHWRW 与实验较弱的 IDYSP 反而保持了较多接触。IHWRW 属于实验强组，但不是实验中最强的肽。这里将指标与 −log10(Kd) 比较，三项指标的 ρ 均为负，观察到的总体趋势与实验相反；但相关性均未达到统计显著。

7条 · 全长proMMP2 · 单条100 ns7 / 7 通过检查

针对 7 条五肽在全长 proMMP2 受体下的单条 100 ns 轨迹（每条 5003 帧，0–100.000008 ns）均通过了质控检查，没有丢帧或 NaN 异常坐标，蛋白、环肽及共价闭环均保持完整。质控通过只说明模拟运算正常，不等于亲和力排序预测正确。

主要 · TIMP2阻断ρ −0.631精确p 0.143 · AUC 0.333

主要 · 表位覆盖ρ −0.487精确p 0.271 · AUC 0.333

辅助 · 结合样状态占比ρ −0.505精确p 0.252 · AUC 0.417

精确排列检验会将七条多肽的实验 Kd 与动力学指标重新随机配对，检查当前的相关程度是否在随机情况下也容易出现。本批结果未达到统计显著；负的 ρ 只是观察到的样本排序趋势，不能保证模型必然会反向预测。

序列	Kd μM	结合样状态占比	接触占有率	平均覆盖率	几何阻断占有率	姿态RMSD 中位数（Å）	环内RMSD 中位数（Å）	与实验相比
WPHPY	1.3	0.3%	4.2%	3.1%	0.3%	54.74	2.33	假阴性
EWWFR	3.7	3.5%	4.8%	2.9%	3.5%	52.81	4.65	低占位
RNWIR	6.3	5.7%	5.7%	5.6%	10.1%	57.42	2.43	低占位
IHWRW	7.4	82.5%	82.5%	35.6%	93.5%	17.10	4.71	相对高估
THNWP	21.0	2.5%	2.7%	15.3%	5.1%	6.57	3.05	低阻断
IDYSP	21.0	52.3%	52.6%	34.2%	80.6%	10.13	2.42	弱肽高估
VEYSP	22.0	6.0%	6.0%	5.2%	13.0%	49.62	1.67	部分高估

WPHPY实验第1 → 主要指标第6/7与第7/7实验最强的肽在模型里接触很少，属于相对低估，也就是这里的“假阴性”。

IHWRW实验第4 → 三项动态指标第1模型把它评到最前，属于相对高估；不表示它在实验中没有活性。

IDYSP弱组 → 三项动态指标第2实验较弱，模型却给了较高接触和阻断指标，是明显需要警惕的误判。

VEYSP弱组 → 阻断与Bound-like第3模拟数值本身不高，但仍排在一些实验强肽之前，因此排序偏高。

分段后，排序有没有改善

把每条 100 ns 轨迹切分成五个 20 ns 时段，再在每个时段内评估七条多肽与实验强弱的关系。下表每行反映的是该时段内七条多肽整体排序的相关性和分类指标，不是单条多肽的瞬时表现。

区间	表位覆盖ρ	TIMP2阻断ρ	Bound-like ρ	主要指标AUC范围
0–20 ns	−0.505	−0.685	−0.559	0.250–0.333
20–40 ns	−0.509	−0.109	−0.109	0.333–0.583
40–60 ns	−0.358	−0.202	−0.202	0.375–0.500
60–80 ns	−0.358	−0.202	−0.202	0.375–0.500
80–100 ns	−0.358	−0.202	−0.202	0.375–0.500

模拟后半段的排序依然没有改善：两个主要指标在全部 5/5 个区间的 ρ 均为负值，没有任何区间达到 AUC ≥ 0.75。这里考察的是排序是否随时间改善，不是证明所有构象都已达到平衡或采样已经充分。

这不是五次独立重复实验：五个时段源于同一条 100 ns 连续轨迹。每条多肽只有一次模拟，不能把分段结果当作独立的重复证据。

统一条件：S-OPLS、SPC水、0.15 M NaCl、300 K、1.01325 bar、MTK-NPT、[2/2/6 fs] RESPA、20 ps记录间隔。姿态RMSD用于看肽的位置变化，环内RMSD用于看形状变化；两者及构象簇占比都不用于亲和力排名。

为什么后续六肽采用短表位模型

后续六肽继续使用 D570–A583 短表位体系

在这七条五肽中，短表位模型比全长模型更接近实验的强弱趋势。因此，后续六肽继续采用短表位，保留完整点击闭环，并使用相同设置进行比较。这是对模型体系的选择，不代表已经验证了它的亲和力预测能力。

WPHPY单残基插入空间108 → 约103

在 WPHPY 的 6 个位置各尝试插入 18 种氨基酸，共 108 次插入。不同插入方式可能得到相同序列，去重后约为 103 条。这是最初的设计规模，不是下方实际完成 MD 的条数。

为什么只是选择模型：只有七条已知肽、每条一次模拟，而且MD与实验构成并不完全相同。后续需要新肽的独立结果检验能否推广；下方六肽颜色建议是看过本批数据后的比较，不是对早期筛选计划的独立验证。

最初的 WPHPY 方案：在哪些位置加一个残基

位置 1X-WPHPY

位置 2W-X-PHPY

位置 3WP-X-HPY

位置 4WPH-X-PY

位置 5WPHP-X-Y

位置 6WPHPY-X

X表示新增的残基，原WPHPY顺序不变。候选的完整化学形式为cy(Pra–六残基核心–Az4)，仍用真实点击骨架闭环，不是普通头尾酰胺环肽。完全重新设计六肽是另一条探索路线，不与这批插入候选混排。

最初规划的筛选步骤，不代表全部已经完成

生成候选多肽

共设计 108 次插入突变，序列去重后获得约 103 条六肽。

检查环肽模型

核对共价闭环键、力场参数、环内应变以及溶液中的游离构象。

生成结合姿态

针对短表位的多种构象，在相同计算预算下进行对接。

明确比较指标

比较表位覆盖率、几何阻断、结合样状态和经过分子尺寸校正的评分。

初步动态检查

最初计划挑选约 10–20 条候选多肽进行显式溶剂 MD 模拟。

补充独立模拟

计划挑选 3–5 条进行重复 MD 采样和 MM/GBSA 计算。

确定实验候选

排查潜在的非特异性接触，挑选 3–5 条结构不同的候选多肽送交实验合成。

主要指标平均表位覆盖率、TIMP2阻断占有率。

辅助判断用结合样状态占比补充判断；接触占有率用于解释，不再作为独立加分项。

计划中的尺寸校正比较界面能时也考虑重原子数，避免只因六肽更大就评分更有利；这里不是新增的计算结果。

只用于查看结构变化姿态RMSD、环内RMSD及构象簇不用于判断哪条肽亲和力最高。

比较时必须有严格的同组参照：原五肽与它衍生的六肽须使用完全相同的计算流程。保持力场、温度、压力、平衡流程、记录间隔和计算预算一致，才能判断插入残基后究竟发生了什么变化。

这一步提供的是后续验证的优先顺序建议：用计算帮助决定哪些六肽值得先做进一步模拟或实验；至于是否真能比原五肽结合更强，仍必须由独立的实验来回答。

六肽筛选结果：从四条五肽出发

上面的 WPHPY 插入路线是最初的设计方案。实际筛选扩展到了 WPHPY、EWWFR、RNWIR 和 IHWRW 四个母本，每组各衍生出 12 条六肽，共 48 条，均已完成 100 ns 模拟。下面按母本分组，查看结合位置、整体表现和模拟前后的变化。

这里的颜色建议是基于本批模拟数据的事后比较，不是对前述筛选计划的前瞻性独立检验，也不能证明结合亲和力已经提高。

比较的对象与范围

从 WPHPY、EWWFR、RNWIR 和 IHWRW 这四条五肽出发，每条插入一个残基，选出 12 条六肽进入 100 ns 分子动力学模拟。这里横向比较这 48 条六肽与各自原五肽在结合位置、表位接触以及模拟前后变化上的差异。

所有体系的受体均为 proMMP2 的 D570–A583 短表位（两端加帽），不是全长蛋白。本页呈现的计算结论仅适用于该模型；实验亲和力是否提高，仍需要后续实验验证。

正在读取多肽名单…

选择一组五肽和六肽

原五肽

母本五肽 · 蓝色

序列

下载母本这一帧的结构（PDB）

插入突变六肽 · 青绿色

序列

下载六肽这一帧的结构（PDB）

建议先验证哪些六肽

蓝色：原五肽绿色：优先补充验证橙色：有优势，也有疑点灰色：暂不优先

这份建议只针对已经进入 MD 模拟的 48 条六肽，不是对全部理论突变序列的排名。标为绿色仅表示在当前模拟中更值得进一步验证；标为灰色绝不代表没有生物活性。三维图中的蓝色和青绿色只用于区分五肽与六肽，不代表活性好坏。

颜色是怎样选出来的？

先看本组五肽和 12 条六肽的两项主要指标：表位覆盖率和几何阻断占有率。如果另一条多肽在这两项上都不低且至少一项更高，就暂不优先标注当前这条。该比较不把两项指标合成为一个加权总分。

在上述未被其他肽同时超越的六肽中，只有同时满足以下条件才标为绿色：轨迹检查通过；全程两项主指标和结合样状态占比（bound-like）均不低于母本；五个 20 ns 时段的两项主指标都不低于母本 100 ns 的全程水平；后 40 ns 按帧加权的 bound-like 不低于该六肽自身的全程值。未全部满足的标为橙色，并在表中注明原因。

这套规则是分析本批数据后确立的事后复核建议，用于排定复查顺序，没有经过实验验证。分段比较所用的参照是母本的全程数值，不是母本对应时段；分段达标也不意味着轨迹已经收敛。后 40 ns 包含在全程之中，两者不是独立样本。RMSD 和构象簇占比不参与选色，辅助判断只参考 bound-like。

在原有七条五肽的短表位验证中，两项主指标与 −log10(Kd) 的 Spearman ρ 约为 0.595，精确排列检验 p 约为 0.170。IHWRW 虽然在模型中长期贴附，却不是实验亲和力最强的肽。这些结果尚不足以把 MD 几何指标当作可靠的亲和力预测工具。

七条五肽的验证报告采样与不确定性的参考文献

下载48条六肽的标注和理由（CSV）下载选色规则与逐条检查结果（JSON）

结合位置对比

显示蛋白片段表面左右同步旋转

正在加载结构…

图 1｜五肽与六肽的结合位置。灰色是蛋白片段，蓝色是五肽，青绿色是六肽。

拖动可旋转，滚轮可缩放。每条多肽只展示模拟中的一个代表帧，用于了解空间相对位置，不能用这一帧概括整条 100 ns 轨迹。如果多肽已经脱离表位，画面会保留其实际距离；可以点击“显示全部结构”查看全局。

同组 13 条肽的 100 ns 结果

比较指标

颜色与上方建议名单一致。每组先列母本，其余六肽按序列字母排列，不是按活性高低排列。点击柱子可查看该肽的时间变化和三维结构。切换到 RMSD 时，颜色不变；RMSD 只描述结构变化，不用于判断亲和力高低。

查看 13 条肽的完整数值

表格里的“与母本之差”均采用百分点表示。例如覆盖率从 40% 变为 50%，差值记录为 +10 个百分点，并不代表实验亲和力提高了 10%。

全部55条肽的100 ns统计（CSV）全部肽的20 ns分段统计（CSV）六肽来源及插入位置（CSV）

同一条肽在模拟前后有没有变化

查看序列下载这条肽的统计与检查结果（JSON）

上一张柱状图概括了 100 ns 的整体表现，但一个平均值不能说明过程。相同的平均值，可能来自一直保持接触，也可能来自前半段贴附、后半段离开。因此，这里把轨迹分成五个 20 ns 时段，看看接触指标有没有随时间改变。RMSD 图显示的是各时段中位数，不是平均值。

如果后几个时段的接触持续下降，需要检查多肽是否正在离开表位；如果数值在后半段上升，也不能草率认定后续会一直维持。五个时段均来自同一条连续轨迹，不是五次独立的重复模拟。

观察指标

查看五个时段的数值

查看结构变化和距离的详细统计

表中的标准差表示单条轨迹内部的波动，不是重复实验的测量误差。RMSD 可以帮助判断多肽移动了多少、环是否变形，不能直接据此推断亲和力。氢键计数沿用原始分析输出；数值为 0 不等于没有氢键，仍需核对分析定义和原始轨迹。

查看每个表位残基的接触情况

查看原始统计和轨迹检查记录

指标含义

本分析中所说的“接触”，均指多肽与表位之间的重原子最短距离不超过 4.5 Å。

表位覆盖率: 表位覆盖率：每一帧中，统计有多少个表位残基接触到多肽，再除以表位的 14 个残基。柱状图显示 100 ns 轨迹的时间平均值；数值越高，表示接触范围越大。
几何阻断占有率: 几何阻断占有率：统计多肽同时接触到至少 4 个 TIMP2 参考位点的帧比例（参考位点共 10 个）。它只表示多肽频繁接触该区域，不等于实验测得的 TIMP2 竞争抑制率。
表位接触占有率: 表位接触占有率：多肽能同时接触至少 5 个表位残基的帧比例，用于反映多点接触表位的状态出现频率。
结合样状态占比（bound-like）: 结合样状态占比（bound-like）：同时满足接触至少 5 个表位残基、接触至少 4 个 TIMP2 参考位点且最近重原子距离 ≤ 4.5 Å 的帧比例。“结合样”是本分析预设的接触状态，不是实验证实的真实结合事件。
结合姿态RMSD: 结合姿态 RMSD：先对齐蛋白，再看多肽相对初始对接姿态改变了多少，包括移动、转向和形变。
环肽内部RMSD: 环肽内部 RMSD：对齐多肽自身后，看环肽的形状改变了多少；不包含它整体离开表位造成的位移。

在部分轨迹中，接触占有率与 bound-like 的数值可能相同，不能算作两份独立证据。每条多肽目前只有一条 100 ns 轨迹，且六肽暂无本实验体系下的实测 Kd；这些动力学指标不能直接换算成亲和力。

另三条五肽的模拟结果：THNWP、IDYSP、VEYSP

这三条已知较弱的五肽没有用于衍生这 48 条六肽，因此这里只列出其数值备查，不加入突变组的横向比较。

数据来源与下载

母本对应关系与插入残基位置来自最初的候选名单，MD 统计量来自已完成的轨迹分析。本页只规范展示方式，没有重新运行模拟，也没有修改原始数据。

三维图里的这一帧是怎样选出来的？

先将每条轨迹中的蛋白片段对齐到统一坐标系，再按环肽所在的空间位置分成五组（K=5）。从帧数最多的一组中，选取最接近聚类中心的真实物理帧作为展示代表。它不是时间平均结构，也不保证此时仍处于紧密结合状态。

空间对齐的参考基准是 EWWFR 模拟起始时的表位（取 14 个标准氨基酸的 Cα）。画面中的灰色片段在空间中保持固定以便叠合比较；下载的 PDB 则保留该帧中受体实际的构象。该空间位置聚类采用 K=5 的 K-means 算法，与 MD 统计中的姿态 RMSD 分簇不是同一算法，各簇的比例也不用于亲和力排序。

在 PDB 文件中，含 Pra/Az4 的非天然闭环配体统一保存在 X 链（残基名 UNK900），共价连接拓扑来自 CMS 文件。原来导出的其他簇代表帧仍完整保存在项目中，不在本页逐一展示。

统计区间与轨迹检查说明

六肽的分段统计直接取自原分析表；五肽按相同的 20 ns 时段，从逐帧数据汇总。各时段的帧数略有不同，全程平均按实际帧数计算；不能简单平均五个时段的 RMSD 中位数来代替全程中位数。

部分五肽没有找到与六肽同格式的轨迹检查汇总表，因此页面注明“未提供”；这仅代表缺少该格式的文档，不等于质控合格，也不据此认定模拟运行失败。

母本衍生关系来自 pre_rosetta_shortlist.csv 的 provenance_json 字段；100 ns 全程指标来自各体系 analysis/summary.json；六肽分段表来自 time_block_metrics.csv，五肽逐帧表来自 frame_metrics.csv。下载文件均保留了原始字段名和来源路径，方便核对溯源。

全部结构与MD数据索引（JSON）三维图使用的蛋白片段（PDB）NGL许可证

三维图使用本地 NGL 2.5.0，图表使用本地 ECharts。浏览时在浏览器中完成渲染，不向第三方分析服务上传分子结构。