当前笔记本优先选择“结构先行”的三段组合

针对只有 target PDB、hotspot residues 和 peptide length，没有已知 binder的任务，当前最合适的主线是：官方 RFpeptides/RFdiffusion 生成环肽骨架 → ProteinMPNN v_48_020 设计肽链序列 → AfCycDesign 进行循环感知的独立重折叠和初筛。CycleDesigner/CycRFdiffusion 保留作第二套骨架生成器；HighFold3 等硬件升级或需要非天然氨基酸时再接回。

同一范式从通用蛋白设计，发展到环肽专项并完成实验闭环

三个方向分别看：骨架生成、序列设计、循环结构验证

RFdiffusion 的 7 个本地 checkpoint 是不同任务权重，不是 7 代软件。ProteinMPNN 的数字后缀表示训练时坐标噪声；HighFold/2/3 才是清晰的三代模型家族。

保留 CycleDesigner 的五段结构，只替换当前跑不动的验证器

这台笔记本完成一次轻量计算约 1–2 分钟

只有 N=1 是真实计时；20/100 个是按当前串行实现做的容量规划。正式筛选若增加每骨架序列数、5 个 AF2 模型和 3–6 次 recycle，验证阶段可能成为主要耗时。

当前能跑 AfCycDesign；未来用 HighFold3 扩展化学空间

关键边界：AfCycDesign 可以替代当前 canonical cyclic peptide 的结构初筛，但不是 HighFold3 在非天然氨基酸和 CCD 化学表达上的功能等价替代。

一次端到端计算已完成，但该候选应被淘汰

证据目录：/home/luohaoxuan/work/rfpeptide_pipeline/outputs/20260902_162243/

一条命令运行完整三段流程

cd /home/luohaoxuan/work/rfpeptide_pipeline
bash run_pipeline.sh target.pdb "A45,A48,A52" 12 18 20

若只想运行旧的两段生成链路，可追加 --skip-afcycdesign。可用 --af-model model_1_ptm 和 --af-recycles 1 控制当前轻量评分配置。

输出目录和三个隔离环境

当前最重要的风险与下一步

1. 热点质量决定搜索空间。热点编号正确并不代表它们可结合；应基于表面暴露、功能界面和实验知识选择。
2. 生成阶段会有较高淘汰率。需要批量生成不同长度和随机种子的骨架，而不是对一个候选过度解释。
3. 当前评分是轻量配置。真实回归仅使用一个 AF2 模型、一次 recycle，适合冒烟测试；正式筛选应提高 recycles、模型数并做复现。
4. iPAE 与 RMSD 是筛选器，不是亲和力。它们衡量模型置信度与自洽性，不能直接替代 Kd、SPR/BLI 或细胞实验。
5. AfCycDesign 主要覆盖标准氨基酸环肽。引入非天然氨基酸、修饰基团或更复杂化学约束时，应回到 HighFold3/AF3 或其他显式化学建模方案。
6. 尚未包含精细物理优化。当前没有 Rosetta relax、能量分解、长时间 MD 或溶剂自由能计算。
7. 多链 target 通过顺序拼接做对齐。脚本已处理多链 target，但输入链顺序和残基完整性仍需保持一致。

从方法范式、环肽专项到实验命中，证据链是连续的

原始论文与官方实现

1. Watson et al. De novo design of protein structure and function with RFdiffusion. Nature, 2023.
2. Zhang et al. CycleDesigner: Leveraging CycRFdiffusion and HighFold to Design Cyclic Peptide Binders for Specific Targets. Journal of Chemical Information and Modeling, 2025.
3. Cho et al. AI-guided design of cyclic peptide binders targeting TREM2 using CycleRFdiffusion and experimental validation. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, volume 133, April 2026.
4. Vázquez Torres et al. Accurate de novo design of high-affinity protein-binding macrocycles using deep learning. Nature Chemical Biology, 2025.
5. Dauparas et al. Robust deep learning–based protein sequence design using ProteinMPNN. Science, 2022.
6. Rettie et al. Cyclic peptide structure prediction and design using AlphaFold2. Nature Communications, 2025.
7. Zhang et al. HighFold, 2024；Zhu et al. HighFold2, 2025；Cao et al. HighFold3, 2025.
8. 官方实现：RFdiffusion/RFpeptides；ProteinMPNN；CycleDesigner；TREM2 pipeline.
9. Google DeepMind. AlphaFold 3 官方安装与资源要求.

TREM2 论文对 TP4 的原文结论是 weak but reproducible binder；这里不把它表述为高亲和力命中。报告中的 iPAE < 0.3、peptide Cα RMSD < 1.5 Å 是工程筛选门槛，不等同于实验亲和力。